Alla toalettskyltar som hänvisar män eller kvinnor till specifika toaletter kommer nu att bytas ut mot unisex-skyltar.
– Vi har kommit ännu ett steg närmare att bli en plats där alla kan leva med värdighet, fria från rädslor och fria från fördömanden, säger de Blasio.
Liknande lagar har införts i Philadelphia, Washington och Austin.