Patienten som vårdbiträdet behandlade var en präst som hade smittats av ebola under sitt missionärsarbete i det drabbade området i Västafrika. Han flögs tillbaka till Madrid för vård i början av augusti, där han senare avled.
Hälsodepartementet i Madrid bekräftar att det spanska vårdbiträdet är ebolasmittad.
– Två tester har gjorts och båda var positiva, säger en talesperson för regionala hälsodepartementet i Madrid, uppger AFP.
Närstående övervakas
Nödåtgärder har införts i Madrid för att spåra hur vårdbiträdet smittades. Sköterskan började känna sig sjuk den 30 september men det var först i dag som det konstaterades att hon var smittad. Människor som har kommit i kontakt med sköterskan övervakas nu.
Sköterskan är den tredje som behandlas för sjukdomen i Spanien och den första där patienten inte har förts hem från Afrika.
En ebolasmittad man i USA togs i förra veckan in på sjukhus utan att ha förts hem med ambulansflyg och amerikanska myndigheter utreder om någon kan ha smittats innan mannen isolerades.