Endast en röst fattades, vilket ses som ett stort bakslag för Republikanerna, men en seger för miljöaktivister.
Ledningen skulle transportera olja från Kanada till USA, men beslutsprocessen har dragit ut på tiden flera år. President Barack Obama har motsatt sig byggandet av miljöskäl.
Inte slutet
Nattens besked innebär dock inte slutet för projektet. Republikanerna har lovat att ta upp det igen i januari, när de nya senatorer som valdes i mellanårsvalet nyligen har tillträtt.
– Det här kommer att bli en fråga tidigt i nästa kongress, säger den blivande majoritetsledaren, Mitch McConnell från Kentucky, efter omröstningen.
Förslaget, som förutom republikanerna stöds av en del demokrater, behöver 60 av senatens 100 röster för att gå igenom.